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酵母蛋白表达流程

2025-02-25
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用于重组药物生产的表达系统主要包括原核表达系统、哺乳表达系统、植物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统和酵母动物细胞表达系统。酵母表达系统是一种经济高效的真核蛋白表达系统,可以成功实现胞内表达或是分泌表达,且其放大培养基相对廉价,培养条件要求不高,适宜工业放大。与哺乳动物细胞表达系统一样,酵母蛋白表达系统能够对所表达蛋白进行例如糖基化、酰基化、脂基化、磷酸基化等保证蛋白天然构象的修饰,可用于制备非常接近天然蛋白的具有高附加值的蛋白原料。

常用酵母表达系统:酿酒酵母表达系统、甲醇营养型酵母表达系统、裂殖酵母表达系统。以毕赤酵母表达外源基因为例,包括如下步骤:

1. 将目的基因克隆进毕赤酵母表达载体。

2. 收获阳性重组表达质粒后,用适当的限制性内切酶酶切阳性重组质粒,使其线性化。

3. 将线性化的阳性重组质粒转化入赤酵母菌株(如GS115)。

4. 将转化物接种至HIS4缺陷平板进行第一轮筛选,选用不同浓度的G418平板进行第二轮筛选。

5. 挑选10~20个克隆进行小规模诱导培养。

6. 鉴定外源基因的表达量,挑选高水平表达菌株进行大规模诱导培养,以制备外源基因的表达蛋白质。

毕赤酵母表达系统主要优点:

1. 具有醇氧化酶(AOX)基因的启动子,可严格调控,实现高水平表达。

2. 强烈的好养生长偏爱性,可进行细胞高密度培养,发酵罐可达120g/L。

3. 具有真核细胞翻译后修饰的功能,蛋白更具生物活性。

4. 高水平分泌表达外源蛋白,有利于纯化。

5. 可实现胞内表达和胞外分泌表达两种形式。

目前至少有4种不同的方法可以将外源质粒DNA导人毕赤酵母中:原生质体转化法、氯化锂(LiCl)转化法、PEG1000转化法和电转化法(electroporation)。其中电转化法是最常用的。

 


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