一．基因敲除原理

基因敲除是将基因组中特定的一个基因去除、替换或灭活，然后从细胞或整体观察该基因的功能。通过选择合适的质粒，将靶基因两侧的同源序列克隆至载体上，转入宿主菌后通过同源重组实现对靶基因的置换敲除。需要根据宿主菌的特点来构建相对特异的基因敲除系统。

二．同源重组技术敲除靶基因的机制（以细菌为例）

将目的基因（待敲除的靶基因）两侧的同源序列（分别为同源臂A/B）克隆至复制起始子缺陷的质粒中，一般在两段同源臂之间有一段抗性基因（图1-A）。质粒通过同源重组整合至细菌基因中（图1-B）。在容纳条件下，通过质粒的滚环复制发生单交换和双交换，单交换重组时形成含有野生型和突变型同源序列的部分二倍体细胞，靶基因敲除不成功。双交换重组时，随着质粒的切除，要么突变型同源序列留在细菌基因组中，带有野生型的质粒被切除，靶基因敲除成功（图1C-1）；或者野生型序列留在细菌基因组中，因同源重组质粒切除，靶基因敲除不成功（图1C-2）。在大多数菌株中，同源重组是一个低概率事件，所以需要插入抗性标记帮助筛选突变株。除非是重组质粒携带反向选择标记，否则质粒切除或丢失发生的概率都非常低，需要大量精力来筛选突变株。

图1 同源重组示意图

三．CRISPR/Cas9基因敲除技术

CRISPR/Cas系统主要受启发于含有CRISPR序列的细菌，当病原体首次感染细菌时，Cas蛋白复合体（Cas1和Cas2蛋白）从入侵的病原体DNA中依据候选识别位点和毗邻基序PAM位点获取原型间隔序列，将此序列从5’端（即靠近前导序列的位置）开始插入到非重复间隔序列中，从而形成侵入记忆，当病原体再次感染细菌时，CRISPR首先会转录出长链CRISPR序列前体（pre-crRNA）和tracrRNA，随后tracrRNA与pre-crRNA的重复序列互补配对形成回文结构，通过RNaseIII酶的加工变为成熟的短的CRISPR RNA（crRNA）和tracrRNA复合物，Cas9蛋白因为回文结构与crRNA和tracrRNA复合物特异性结合，从而与入侵病原的原型间隔序列配对。随着技术的改进和应用，科学家将crRNA和tracrRNA复合物结合形成gRNA。在gRNA的指导下，Cas9蛋白跟踪到PAM序列附近，对外源双链DNA进行识别并剪切，其中Cas9蛋白的HNH结构域切割crRNA的互补链，RuvC结构域切割非互补链，从而造成DNA双链断裂。入侵的病原为了生存会通过同源重组或非同源重组将断链的DNA进行修复，从而使病原失活。

图2 CRISPR/Cas9工作原理

四．同源重组技术与CRISPR/Cas9技术优缺点比较

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